DNA qualitative & quantitative analysis

Uji kualitatif dan kuantitatif DNA dan RNA 2010

by Fatchiyah

Metoda standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Selanjutnya, lokasi DNA dalam gel tersebut dapat diidentifikasi secara langsung dengan menggunakan pewarna berfluorescen.

Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr). Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator.

Gel poliakrilamid vs gel agarose

  1. Gel Poliakrilamid
    • Lebih effektif untuk pemisahan fragmen DNA antara 5-500bp
    • Power: ekstrim tinggi
    • Ukuran perbedaan DNA yang terpisah sampai 1bp
    • Pembuatannya lebih sulit dibanding gel agarose, karena biasanya digunakan poliakrilamid dengan resolusi yang tinggi.
    • Medan gerak secara vertikal dan listriknya konstan.
  2. Gel Agarose
    • Power lebih rendah
    • Mempunyai laju pemisahan lebih cepat
    • Dapat memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb tergantung dari konsentrasi gel agarose yang digunakan
    • Medan gerak biasanya horisontal

Electroforesis migration rate

Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose dipengaruhi oleh beberapa factor utama, sebagai berikut:

  1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional  log-10 dari jumlah pasangan basa2.

2. Konsentrasi gel agarose

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: logm=logmo-KrT dimana mo adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan  T adalah gel konsentrasi serta m adalah electrophoretic mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA

No Konsentrasi Gel Agarose (%) Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb)
1 0.3 60-5
2 0.6 20-1
3 0.7 10-0.8
4 0.9 7-0.5
5 1.2 6-0.4
6 1.5 4-0.2
7 2.0 3-0.1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

  • terutama konsentrasi gel agarose
  • kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
  • densitas kembaran superheliks pada bentuk I
  • pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
  • tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I
  • konsentrasi EtBr kritis antara 0.1mg/ml-0.5ml/mg

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar

6. Keberadaan pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.

7. Komposisi buffer elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Misal:

a. Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.

b. Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose.

Comment Feed

No Responses (yet)



Some HTML is OK

or, reply to this post via trackback.

CAPTCHA Image
*