Lecture 4, by Fatchiyah

Probe is labeled, defined sequence used to search mixture of nucleic acids for molecule containing a complementary sequences.

click here Molecular probe – ppt

HIBRIDISASI

Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses renaturasi dengan cara pendinginan.
Pengujian sel bakteri pembawa rekombinan, gen-gen target, level mRNA, hasil pemotongan ER (RFLP) dan uji lainnya yang  menggunakan teknik hibridisasi, membutuhkan proses denaturasi dan fragmen asam nukleat yang tidak diketahui dan memfiksasi fragmen tersebut pada bahan solid seperti filter nitroselulosa. Untuk pengujian dengan hibridisasi diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampurkan dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid tersebut pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid. Keadaan tersebut sangat penting dalam aplikasi kebanyakan diagnostik mikrobiologi yang memiliki konsentrasi DNA target sangat sedikit dan membutuhkan waktu diagnosis lebih cepat. Probe dapat juga dibuat dari oligonukleotida (biasanya terdiri dari 30-40 nukleotida) yang dibuat secara sintetik. Oligonukleotida tersebut dapat berupa fragmen DNA rantai tunggal atau fragmen RNA yang dilabel.
Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau membrane nitroselulosa. Transfer DNA disebut ‘Southern blotting’, mengacu kepada nama penemu teknik tersebut yaitu  E.M. Southern (1975).  Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan.  Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat.  Semua fragment hasil pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal.  Pola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel.

Gambar  . Skreening pustaka DNA genomik (www.personal.psu.edu/rch8/workmg/Isolat_analy…).
Untuk identifikasi bakteri atau sel inang yang membawa plasmid rekombinan juga dilakukan hibridisasi dengan menggunakan membran nitrosellulosa yang meiliki ukuran dan bentuk sesuai dengan petridish yang digunakan. Membran ditempel ke medium LB yang telah ditumbuhi koloni bakteri, kemudian membrane diambil dan petri berisi koloni bakteri diinkubasi lagi untuk ditumbuhkan kembali. Kemudian membran diinkubasi bersama probe DNA Bila antara probe dan DNA target merupakan komplemen maka akan terjadi hibridisasi.  Bila probe yang digunakan dilabeli maka selanjutnya dupleks yang terjadi dapat dideteksi.
Bila kondisi hibridisasi yang digunakan mempunyai stringency yang tinggi (highly stringent), maka tidak akan terjadi hibridisasi dengan DNA yang mempunyai kekerabatan yang jauh atau non homolog.  Jadi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan secara ideal homolog diantara beribu-ribu atau bahkan berjuta-juta  fragmen yang bermigrasi sepanjang gel.   Fragmen yang diinginkan dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membran yang telah mengalami hibridisasi pada film. Ada berbagai cara untuk memperoleh dari melabel probe asam nukleat. Sebuah gen dan agen penyakit yang akan dideteksi harus dimurnikan terlebih dahulu, kemudian dilabel apakah dengan radioisotop seperti 32P atau dengan substansi non-radioisotop. Walaupun substansi non-radioisotop dan dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Sensitifitas uji diagnostik menggunakan probe yang dilabel dengan non-radioisotop dapat ditingkatkan dengan penggunaan PCR. Substansi non-radioisotop yang paling sering digunakan sebagai label adalah biotin dan digoxigenin.