DNA Isolation

ISOLASI DNA

Oleh

Fatchiyah

Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan protein histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal.

Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyak faktor. Seperti temperatur, T-melting (Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila temperatur ini diturunkan secara perlahan maka terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula. Derajat keasaman (pH) yang ekstrim (pH<3 atau pH>10) maka DNA akan terdenaturasi. Selain kedua faktor itu, konsentrasi iso elektrolit seperti Na+ dan K serta ratio kandungan antara basa nukleotida GC terhadap AT, misal tingginya kandungan GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA.

Untuk memperoleh isolat DNA dari sampel ada beberapa hal yang harus dilakukan dengan benar, yaitu

  1. Pemecahan dinding sel-sel atau jaringan yang akan diisolasi DNA-nya, seperti sel-sel darah merah, kultur sel bakteri, dan jaringan hewan atau tanaman. Sel-sel dari kultur sel atau bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 8.000-10.000 rpm selama 10 menit.

Pemecahan dinding bakteri dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu:

(1)   Secara fisik: sel dipecah dengan kekuatan mekanik atau resonansi

(2)   Secara kimiawi : sel dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia yang dapat merusak intregitas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai biasanya, al.: lisosim, EDTA (etilen diamin tetra asetat), Tris-Cl, atau deterjen, SDS (sodium dodecyle sulphate).

  1. Debris sel dipisahkan dari larutan DNA.
  2. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni.
  3. Presipitasi DNA dengan ethanol dingin
  4. Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan salah satu kemikalia seperti berikut ini: Fenol, Fenol : kloroform, Isopropanol, Fenol:kloroform:isoamylalkohol.
  5. Selain itu untuk pemurnian DNA dari kontaminan protein digunakan enzim protease yaitu Pronase atau Proteinase-K, dan kontaminan RNA dengan menggunakan RNase.
  6. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat dilakukan dengan menggunakan densitas gradien sentrifugasi Cesium Chlorida (CsCl), dengan cara ini DNA akan terpisah pada band yang berbeda dengan protein dan RNA bahkan antara linier DNA dan sirkuler DNA. Selain itu, dengan menggunakan garam dengan konsentrasi tinggi, seperti 0,25 M sodium acetate atau 0,1 M sodium chlorida.
  7. Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan menggunakan ethanol yang dingin dibawah kondisi ionik yang kuat. Dan dicuci dengan EtOH 70%.
  8. Pellet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril.

 

Preparasi DNA bakteriophage atau virus

Preparasi DNA bakteriophage atau virus, sedikit agak berbeda dengan sel-sel bakteri, yaitu:

  1. Phage diisolasi dari kultur sel-sel yang terinfeksi.
  2. Dilakukan sentrifugasi dengan ultra sentrifugasi, sampai diperoleh supernatan berisi phage dan terpisah dari kultur selnya (dalam bentuk endapan atau pellet).
  3. Tambahkan PEG (poli ethilen glikol) + NaCl untuk presipitasi partikel phage, sentrifugasi dan diperoleh pellet phage murni.

 

DNA dari sel-sel atau jaringan tanaman

Sedangkan preparasi DNA dari sel-sel atau jaringan tanaman yang harus diperhatikan adalah jaringan tanaman diperlakukan terlebih dahulu dalam Nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan penggerusan agar diperoleh ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel diperlakukan dengan ekstrak buffer yang dicampur dengan b-merkaptoethanol (fresh), dan selanjutnya seperti jaringan atau organisme yang lain.